一、微生物污染
盡管標準建議對微生物含量進行評估，但微生物含量本身并不影響指定的純度等級。可接受的微生物數(shù)量需要單獨評估；這種評估基于對 GMP 的解釋。例如，2004 年美國食品及藥物管理局無菌灌裝指導文件指出 (4)：“壓縮氣體應具有適當?shù)募兌龋ㄈ绮缓停溥^濾后的微生物和顆粒質(zhì)量應等于或優(yōu)于氣體引入環(huán)境中的空氣質(zhì)量”。在純度方面，制藥行業(yè)的許多部門將根據(jù)允許的最大顆粒數(shù)使用 1 級壓縮氣體。顆粒限制為：
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ISO 8573等級
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每m3顆粒限制
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0.1~0.5μm
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0.5~1.0μm
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1.0~5.0μm
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1
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≤20000
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≤400
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≤10
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除 ISO 8573 標準外，輔助信息載于《ISPE 良好操作指南--工藝氣體》（2011 年）(5)。ISPE 指南中的表 7.1（參考附錄 1）指出，顆粒計數(shù)（可存活的和惰性的）應為 “通常等于所服務區(qū)域的靜止狀態(tài)"。也就是說，對于歐盟 GMP A 級/ISO 14644 5 級區(qū)域，微生物數(shù)量應小于 1 CFU/m3，顆粒水平應符合區(qū)域靜止狀態(tài) ≤ 3,520 個顆粒/m3 @ > 0.5μm。
對于壓縮空氣的生產(chǎn)，也有單獨的標準（ISO 12500）。ISO 12500 沒有具體的微生物測試要求。
二、微生物存活率
根據(jù)上述情況，微生物的最大含量將適用于潔凈室等級。這就嚴格限制了 ISO 14644 5 級/歐盟 GMP A 級區(qū)域。
雖然壓縮氣體和空氣系統(tǒng)的環(huán)境相對惡劣，但如果有可用的營養(yǎng)物質(zhì)，它們也能幫助微生物存活。營養(yǎng)物質(zhì)的可用性取決于氣體和空氣的純度。適合微生物代謝的營養(yǎng)物質(zhì)包括水和油滴。另一個影響生存的因素是溫度，尤其是在氣溫較高的地方。(斯圖爾特等人，1995 年）
除了無性細胞，細菌孢子也能在惡劣的環(huán)境條件下生存。孢子對壓縮氣體管道內(nèi)的溫度范圍和濕度水平有很強的抵抗力。另一個風險是生物膜，微生物群落可能會通過附著在氣管和管道上而形成和發(fā)展。
雖然存在這些風險因素，但通常不會從壓縮氣體管路中回收微生物。研究表明，許多微生物可以在壓力高達 10 巴的加壓系統(tǒng)中存活和繁殖，大約 85% 的微生物在加壓后能夠恢復。(Zinge, 2013）此外，研究還表明，大腸埃希氏菌（Escherichia coli）和枯草棒狀桿菌（Corynebacterium xerosis）可在 300 atm（= 300 bar）的極限減壓條件下存活，而這與壓縮氣體采樣器中 10 bar 至 1 atm 的減壓條件相差甚遠。(Zinge, 2013）
然而，在 160 巴壓力（2,320.6 磅/平方英寸）及以上的壓力下，存活率往往相當?shù)汀?Sandle, 2015 年 8 月）
雖然壓縮空氣或氣體中的微生物污染很少發(fā)生，但還是有可能發(fā)生，即使是低水平的計數(shù)也需要進行調(diào)查。污染源包括：
? 氣體來源。來自周圍環(huán)境的吸入空氣，其中可能含有油、污垢/灰塵、濕氣/水蒸氣和微生物。
? 管道分配系統(tǒng)。管道分配和儲氣罐在舊系統(tǒng)中更為常見，除細菌外，還會有鐵銹、管垢和礦物質(zhì)沉積等形式的污染物。
? 細菌滯留過濾器。過濾器可能會堵塞、失去完整性或變濕。
? 壓縮機故障。壓縮機本身會造成污染環(huán)境。例如，壓縮機的預過濾器可能因灰塵和絨毛過多而導致過濾器無法正常工作。
? 取樣閥。使用點取樣閥可能設計不當或出現(xiàn)故障。此外，閥門的類型也可能選擇不當 - 應該是特氟龍閥門。
三、需要減壓
在對壓縮氣體進行采樣時，必須調(diào)節(jié)進入顆粒計數(shù)器或微生物空氣采樣器的流量。如果不能調(diào)節(jié)流速，可能/將會導致一些問題：
? 粒子計數(shù)器： 該儀器根據(jù)粒子計數(shù)器流速下的預期電響應對粒子進行計數(shù)和尺寸測量。電脈沖越大，顆粒的尺寸就越大。反之，電脈沖越低，顆粒越小。因此，將 50 psi 等高壓源直接連接到 50 LPM 粒子計數(shù)器上，會導致氣體中的任何粒子以明顯加快的速度飛過視體積（粒子計數(shù)器內(nèi)被激光束飽和的區(qū)域），并導致粒子尺寸嚴重偏小。
? 微生物空氣采樣器：除其他因素外，微生物采樣器的流速和入口幾何形狀（即采樣頭中孔的數(shù)量和直徑）都是經(jīng)過計算的，以便為存活的微生物撞擊瓊脂提供一定的速度。必須根據(jù) ISO 14698 標準對這一流速和入口幾何形狀進行物理和生物效率測試。將 50 psi 等高壓源直接連接到 100 LPM 微生物采樣器會提高物理回收率，但加快的撞擊速度會導致微生物回收率顯著下降。更簡單地說，這將對生物效率產(chǎn)生嚴重的不利影響。(Stewart 等人，1995 年）瓊脂干燥是另一個令人擔憂的問題。無論使用何種生長培養(yǎng)基，將其置于高流速下都可能導致瓊脂干燥，從而進一步降低生物效率。
? 可能造成災難性損害： 將高壓氣體強行注入顆粒計數(shù)器或微生物采樣器可能會導致排氣過濾器發(fā)生災難性故障。它還可能導致泵或真空源損壞以及其他損壞。
? 樣品體積不確定性： 粒子計數(shù)器或微生物采樣器的采樣時間基于儀器的流速。例如，在 100 LPM 的流速下，一個立方米的采樣時間需要 10 分鐘。顯然，直接將高壓氣體連接到儀器上很可能會導致采樣嚴重過量。
大多數(shù)制藥氣體的儲存壓力通常在 10-11 巴（145 - 160 psi）或更高。然后，氣體會經(jīng)過一個調(diào)節(jié)器，將壓力降低到一般介于 4-7 巴（55 - 100 psi）之間，再經(jīng)過一個 HEPA 過濾器。即使在此壓力下，也需要進一步降低壓力，將氣體降至大氣壓水平（約 1.1 巴），以便顆粒計數(shù)器或微生物采樣器正常將氣體吸入儀器。
四、消毒
微生物采樣器的頭部和任何附件在使用前必須無菌，以避免污染和交叉污染。與儀器一起使用的培養(yǎng)基應是無菌的（通常是通過輻照），并對具有代表性的培養(yǎng)基 進行過促進生長測試。樣本頭、試管和適配器應可高壓滅菌。有些用戶會用 70% 異丙醇等消毒劑對連接采樣器的管道和軟管進行消毒。ISO 標準中將此作為一個選項，但卻錯誤地將其描述為 “消毒”。在使用消毒劑的情況下，必須在沒有瓊脂板的情況下讓空氣流過采樣器；這對蒸發(fā)消毒劑和去除任何殘留物都是必要的。消毒劑的存在有可能導致假陰性。
五、瓊脂和培養(yǎng)
壓縮空氣取樣應與潔凈室評估一起構(gòu)成環(huán)境監(jiān)測計劃的一部分。該計劃應考慮到需要檢測的空氣點。這可以是每個點，也可以是被認為風險較大的點，如產(chǎn)品接觸點，或者是環(huán)路上的代表性點。還必須根據(jù)風險評估考慮檢測頻率。
采樣時間應足以采樣一立方米的氣體。取樣后，取出瓊脂平板，在微生物實驗室內(nèi)進行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，檢查瓊脂是否有菌落形成單位。如果發(fā)現(xiàn)菌落形成單位，則應根據(jù)適當?shù)南拗祵ζ溥M行評估。良好的做法是對回收的污染物進行鑒定；鑒定可提供重要信息，幫助確定細菌的來源，以及是否是令人反感的物種。[Sandle, 2015］
在培養(yǎng)基方面，Climet CI-9xA 系列可將空氣樣本收集到 90 毫米培養(yǎng)皿或 RODOC 平板上。
必須選擇適當?shù)沫傊８鶕?jù) USP <1116>，大豆酪蛋白消化培養(yǎng)基 (SCDM) 等普通微生物生長培養(yǎng)基在大多數(shù)情況下都適用于環(huán)境監(jiān)測，因為它能支持多種細菌、酵母菌和霉菌的生長。這種培養(yǎng)基可作為補充，以盡量減少消毒劑或抗生素的影響（USP <1116>）。此外，為測量細菌量而采集的空氣樣本使用 TSA（胰蛋白酶大豆瓊脂）或大豆酪蛋白消化液 (SCDM) 作為采集生物的生長培養(yǎng)基，而為檢測空氣中的真菌量而采集的空氣樣本則使用 MEA（麥芽糖提取物瓊脂）或沙伯呋喃葡萄糖瓊脂。值得注意的是，只有被歸類為高風險的復方制劑才需要進行真菌檢測（USP 1116，修訂公告，第 25 頁）。
不過，大多數(shù)藥品都使用 TSA，這是一種營養(yǎng)性一般的培養(yǎng)基，旨在回收各種細菌和真菌。(Sandle, 2015）
瓊脂培養(yǎng)基應盡快從采樣器中取出，并轉(zhuǎn)移到所需的培養(yǎng)箱中。這是為了避免培養(yǎng)基變干或變質(zhì)。
在選定的培養(yǎng)條件下，時間和溫度應適合回收各種微生物，尤其是革蘭氏陽性微生物，因為這類細菌更適合在干燥的環(huán)境中生存（Moissl Eichinger, 2012）。
典型的要求是尋找中嗜性細菌和真菌（可在 20-30 攝氏度的溫度范圍內(nèi)生長的細菌和真菌）。一些用戶會選擇使用一種代表性溫度，而另一些用戶則會選擇使用兩步培養(yǎng)法，例如： (Sandle，2014 年；和 USP <1116>)
? 20-25℃ 3-5 天，然后是
? 30-35℃ 3-5 天。
選定的培養(yǎng)時間應基于促進生長的研究。如果某些微生物被認為是一個問題，可考慮使用其他培養(yǎng)時間或培養(yǎng)基。
六、取樣閥
無論是進行可行或不可行測試，開/關(guān)閥門都應完全打開。我們不建議用戶嘗試手動調(diào)節(jié)壓力，而是讓高壓擴散器發(fā)揮其作用。如果排出的氣體過多，可能需要換一個擴散器。
七、取樣頻率
用戶需要確定每條壓縮氣體管路是否需要檢測以及檢測的頻率。當然，所有與產(chǎn)品接觸的壓縮氣體都應進行評估。取樣計劃還應考慮并適應以下情況：
? 增加或減少的生產(chǎn)計劃
? 季節(jié)性變化
? 設備變更和修改
? 更換硬件或過濾器和干燥器
? 系統(tǒng)閑置。
八、測試報告樣本
樣本測試報告見 ISO 8573-4 附件 A（非活性顆粒）和 ISO 8573-7 附件 A（活性顆粒）。